G418（Geneticin）
G418，即遗传霉素（Geneticin），是一种氨基糖苷类抗生素，结构与庆大霉素B1相似。G418最初是于细菌小单孢菌中发现。G418是新霉素的类似物，其作用机理也与新霉素相似。即，G418可以通过阻断多肽合成（蛋白转译）杀死原核细胞或真核细胞。新霉素抗性基因neo可以编码一种能使G418失效的酶氨基糖苷3'磷酸转移酶，进而使细胞获得对G418的抗性。在实验室中，利用上述机制，可以使用G418筛选基因工程改造后的原核或真核细胞。溶于水、甲醇。分子式为C20H40N4O10·2H2SO4，分子量692.71，CAS：108321-42-2，熔点138-144°C。冰袋运输，-20℃干燥保存，有效期两年。
使用方法
1、G418储存液的配制（50mg/mL，活性浓度）
1）活力单位的换算
根据此公式进行换算：（1000/A0）×A1=A2，其中A0是G418的活力值（Potency），因批次而异，可见批次对应的质检报告，或者瓶子上的标签。A1是想配制的活性 G418浓度。A2是实际称重的粉末与体积比浓度。
例如：G418活力值为：750μg/mg，要配制50mg/mL的G418活性浓度，则实际要配制的粉末浓度为1000/750×50mg/mL=66.33mg/mL。如果配制10mL的G418储存液（活性浓度，50mg/mL），则需要称取663.3mg粉末。
2）除菌和保存
根据上述换算得到的实际粉末称重，加入10mL无菌去离子水内使其完全溶解。0.22μm过滤，除菌后分装到-20℃冻存，1年稳定。
注：①不要对混浊的溶液进行过滤，因为混浊的溶液意味着未完全溶解，过滤过程中会造成药物损失，降低终液的活性。
②不建议使用液体培养基，氯化钠溶液，磷酸盐溶液或者有机溶剂来制备储存液。
2、常用筛选浓度
一般来说，刚开始筛选转化子需要高浓度的G418，后续用较低浓度的G418维持培养。生长条件、细胞类型和其他的环境因素都可能影响G418的用量，因此第一次使用的实验体系建议通过杀灭曲线（kill curve），即剂量反应性曲线，来确定最佳筛选浓度。
通常情况，哺乳动物细胞筛选范围200-2000μg/mL；植物细胞：10-100μg/mL；酵母细胞：500-1000μg/mL；以下是一些细胞类型使用G418筛选使用的浓度，可做参考。
细胞类型 | 激活浓度（μg/mL） | 应用 |
网柄菌属 | 10 | 培养液培养 |
30 | 冻干细菌培养 | |
哺乳动物 | 400 -1000 | 筛选 |
200 | 维持生长 | |
植物 | 25-50 | 筛选 |
10 | 维持生长 | |
酵母 | 500 | 筛选 |
125-200 | 维持生长 | |
细菌 | 8-16 | 筛选 |
3、杀灭曲线的建立
为了筛选得到稳定表达目的蛋白的细胞株，需要确定能够杀死未转染宿主细胞的抗生素最低浓度，可通过建立杀灭曲线（剂量反应曲线）来实现，至少选择6个浓度。处理分裂期的细胞时G418的活性最强，因此在添加G418之前需要让细胞培养一段时间。
1）按照20-25%的细胞浓度将未转化的细胞铺在合适的培养板上，37℃，CO2过夜培养；
注：对于需要更高密度来检测活力的细胞，可增加接种量。
2）根据细胞类型，设定合适的浓度梯度。以哺乳动物细胞为例，可设定0，50，100，200，400，800，1000μg/mL。
3）第二天换用新鲜配制的含有相应浓度药物的培养基。每个浓度做三个平行孔。
4）接下来每3-4天更换新的含药物培养基。
5）按照固定的周期（如每2天）进行活细胞计数来确定阻止未转染细胞生长的恰当浓度。选择在理想的天数（通常是7-10天）内能够杀死绝大多数细胞的最低浓度为稳定转染细胞筛选用的工作浓度。
4、稳定转染细胞的筛选
1）转染48h后，用含有适当浓度的G418筛选培养基来传代细胞（直接传代或者稀释后传代）。
注：细胞处于活跃分裂状态时抗生素的杀伤效果最好。则当细胞过于稠密，其效率会降低。为了得到较好的筛选效果，最好将细胞稀释至丰度不低于25%。
2）每隔3-4天更换含有药物的筛选培养液。
3）筛选7天后观察并评估细胞克隆（集落）的形成情况。集落的形成可能还需要一周或者更多的时间，这取决于宿主细胞类型，转染，以及筛选效果。
4）挑取并转移5-10个抗性克隆于35mm细胞培养板，继续用含药物的筛选培养液维持培养7天。
5）后续更换正常培养基培养即可。
注意事项
1）G418不可高压灭菌；
2）G418不要和其他的抗生素/抗真菌剂（如青霉素/链霉素）共同使用，因为它们是G418的竞争性抑制剂。其他的抗生素也会产生交叉活性。
3）配制G418溶液时，一定要根据G418批次不同的活力值（potency）来进行换算，从而得到需要活性浓度的储存液以及工作液。
4）G418加入培养体系中未转染的细胞有可能不会被杀死，原因在于药物浓度过低，或者细胞密度过高。另外，快速分裂的细胞相对于缓慢增殖细胞，更容易被杀死。对照细胞（未转染）可能抗生素添加5-7天后才能杀死，转染细胞（抗性克隆子）的克隆需要10-14天形成。
5）加入杀死剂量的G418，细胞可能还会继续分裂2-3次。G418的药效通常在2天后才变得明显。
6）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
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